|
|
Expression and purification of proteins with unnatural aminoacids, and determination of their structure by combination of chemical or photochemical modification and mass spectrometry
Bortel, Tomáš ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Inkorporace nepřirozených aminokyselin (NNAA) je široce používaný způsob pro zavedení bioorthogonálních funkčních skupin do proteinů26 . Tyto funkční skupiny lze využít použitím click chemie, konjugací značených proteinů na afinitní nebo fluorescenční sondy. Méně rozšířené využití NNAA zahrnuje výzkum vlivu bioorthogonálních funkčních skupin na strukturně - funkční vztahy v značených proteinech47 . Pro výzkum těchto vztahů je zapotřebí exprimovat velké množství proteinu s maximální inkorporací NNAA. V naší práci jsme nahrazovali methionin (Met) třemi NNAA: foto-methioninem (pMet), azidohomoalaninem (AHA) a homopropargylglycinem (HPG). Zkoumali jsme vliv těchto NNAA na růst prototrofních E. coli BL21 a Met-auxotrofních E. coli B834 v MM- -M9 médiu. Sledovali jsme expresi cytochromu b5 a MBP-GFP. Pro určení míry inkorporace jednotlivých NNAA do těchto rekombinantních proteinů jsme použili MALDI-ToF MS a LC-MS. V porovnání s Met-auxotrofními E.coli B834, prototrofické E. coli BL21 exprimovaly výrazně vyšší množství cytochromu b5 s pMet a AHA, avšak s nízkými inkorporacemi těchto NNAA. Situace byla opačná v B834, které exprimovaly výrazně nižší množství proteinu, avšak s inkorporací pMet od 50 - 70 % a AHA kolem 50 %. Oba bakteriální kmeny s HPG exprimovaly podobné množství cytochromu b5 s...
|
|
|
Proteomická a bioinformatická charakterizace N-terminálních sekvencí proteinů modifikovaných po importu do hydrogenosomu Trichomonas vaginalis.
Zákoucká, Eva ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Trichomonas vaginalis je lidským anaerobním patogenem způsobujícím trichomoniasu, jednu z nejrozšířenějších nevirových pohlavně přenosných nemocí. Toto onemocnění postihující muže i ženy je v současnosti běžně léčeno metronidazolem, avšak jsou známy případy, kdy vznikla rezistence vůči tomuto léčivu. Jelikož je Trichomas vaginalis eukaryotní organismus, je paleta cílů terapeutického zásahu proti tomuto patogenu bez ohrožení hostitele omezená. Během evoluce se Trichomas vaginalis přizpůsobila anaerobnímu prostředí vznikem alternativního anaerobního metabolismu, kdy se mitochondrie přeměnily na organely s výrazně omezenou enzmatickou výbavou. Jelikož je jedním z konečných produktů energetického metabolismu v těchto organelách molekulární vodík, nazývají se tyto organely hzdrogenosomy. Hydrogenosomy nemají vlastní genetickou informaci, všechny proteiny v nich přítomné jsou kódované v jádře, syntetizované na volných ribosomech v cytosolu a poté transportovány do hydrogenosomů pomocí N-koncových presekvencí. Peptidasa rozeznávající a odštěpující tyto presekvence, hydrogenosomální procesující peptidasa, je pro hydrogenosomy unikátní a představuje jeden z mála potencionálních terapeutických cílů pro léčbu trichomoniasy. Cílem této práce bylo určení substrátové specifity hydrogenosomální procesující...
|
|
|
Proteomická a bioinformatická charakterizace N-terminálních sekvencí proteinů modifikovaných po importu do hydrogenosomu Trichomonas vaginalis.
Zákoucká, Eva ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Trichomonas vaginalis je lidským anaerobním patogenem způsobujícím trichomoniasu, jednu z nejrozšířenějších nevirových pohlavně přenosných nemocí. Toto onemocnění postihující muže i ženy je v současnosti běžně léčeno metronidazolem, avšak jsou známy případy, kdy vznikla rezistence vůči tomuto léčivu. Jelikož je Trichomas vaginalis eukaryotní organismus, je paleta cílů terapeutického zásahu proti tomuto patogenu bez ohrožení hostitele omezená. Během evoluce se Trichomas vaginalis přizpůsobila anaerobnímu prostředí vznikem alternativního anaerobního metabolismu, kdy se mitochondrie přeměnily na organely s výrazně omezenou enzmatickou výbavou. Jelikož je jedním z konečných produktů energetického metabolismu v těchto organelách molekulární vodík, nazývají se tyto organely hzdrogenosomy. Hydrogenosomy nemají vlastní genetickou informaci, všechny proteiny v nich přítomné jsou kódované v jádře, syntetizované na volných ribosomech v cytosolu a poté transportovány do hydrogenosomů pomocí N-koncových presekvencí. Peptidasa rozeznávající a odštěpující tyto presekvence, hydrogenosomální procesující peptidasa, je pro hydrogenosomy unikátní a představuje jeden z mála potencionálních terapeutických cílů pro léčbu trichomoniasy. Cílem této práce bylo určení substrátové specifity hydrogenosomální procesující...
|
|
|
Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Petrák, Jiří (oponent) ; Šebela, Marek (oponent)
ABSTRAKT Systém oxygenas se smíšenou funkcí se v organismu podílí na biosyntéze endogenních a také metabolismu exogenních látek (např. léčiv nebo chemických prokarcinogenů). Substráty jsou biotransformovány terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450 (P450). Katalytické vlastnosti některých jejich zástupců (např. studované izoformy 2B4) jsou pozměněny v přítomnosti redoxního partnera - cytochromu b5 (cyb5). Oba cytochromy jsou ukotveny hydrofobními doménami v lipidické membráně endoplasmatického retikula, zatímco jejich katalytické domény jsou exponovány do cytosolu buňky. K rozšíření současných znalostí o struktuře a interakcích studovaných cytochromů byly využity dva přístupy založené na kovalentním síťování aminokyselin v "nulové vzdálenosti" (angl. "zero-length cross-linking"): (1) chemické síťování činidlem 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) propojujícím ve vodném prostředí přístupné karboxylové skupiny s primárními aminy, a (2) síťování pomocí foto-labilního analogu methioninu (pMet), který se po aktivaci UV zářením může vázat na libovolnou aminokyselinu, a to v hydrofobním i hydrofilním prostředí. pMet byl do sekvence cyb5 inkorporován namísto methioninu během rekombinantní exprese proteinu v E. coli, která probíhala v limitním médiu obohaceném o aminokyselinový...
|
|
|
Studium vlastností minoritních strukturních proteinů myšího polyomaviru
Bílková, Eva ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je jedním z modelových zástupců čeledi Polyomaviridae. Kapsida MPyV se skládá z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních proteinů VP2 a VP3. Minoritní kapsidové proteiny pravděpodobně napomáhají přesunu virového genomu přes membránu endoplasmatického retikula na cestě do jádra v časné fázi infekce. Přesný mechanismus však není znám. Pro studium interakce proteinů VP2 a VP3 MPyV s membránou byly v minulosti vytvořeny expresní plasmidy, kódující mutované VP2 nebo VP3 fúzované s EGFP. Tyto proteiny mají delece v předpokládaných hydrofobních doménách. V této práci byla sledována lokalizace mutovaných proteinů v buňkách. Ukázalo se, že pro asociaci VP2 a VP3 s membránou je nejdůležitější hydrofobní doména 2, zatímco domény 1 a 3 jsou spíše postradatelné. Studium VP2 a VP3 pokračovalo dále analýzou charakteru jejich isoforem. Byly separovány isoformy obou proteinů o různé elektroforetické mobilitě pomocí SDS-PAGE. Následná analýza hmotnostní spektrometrií ukázala, že tyto isoformy se liší v důsledku deamidace na asparaginu společném oběma proteinům (pozice 253 pro VP2 a 137 pro VP3). V minulosti byla také identifikována acetylace N-koncového alaninu VP3. Pro studium funkce nalezených modifikací byly vytvořeny mutované viry se substitucemi těchto aminokyselin. Pilotní...
|
host ::
RSS.